甜蜜素的化学名称为环己基氨基磺酸钠,分子式是C6H12 NNaO3 S,具有水溶性好,甜味清爽,稳定性好,热量低等特性,是一种复合食品添加剂。甜蜜素在我国作为人工甜味剂广泛应用于食品工作中,如炒货、酿造、糕点等食品中,长期以来含有甜蜜素的食品出口到包括日本在内的国家和地区。近年来研究发现,甜蜜素因在胃肠道转化为环己胺,可能具有潜在的致癌性,能诱发膀胱癌。一些国家如美国、加拿大、欧盟、日本、印度和香港等国在内的40多个国家禁止使用甜蜜素作为食品甜味剂。我国目前允许甜蜜素的使用。目前我国食品中甜蜜素检验的国家标准和国内研究报告的技术路线主要是气相色谱法、分光比色法和薄层层析法,国标最低检测限为4μg (相当于400 mg/kg) ,有报道采用液相方法检测限为50 mg/L,同样达不到国外无残留检测要求。为解决甜蜜素最低检测限问题,我们参考国内外相关研究,建立一种快速简便、适用于食品中微量甜蜜素测定的HPLC方法。

1　材料与方法

1.1　仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪。

1.2　试剂

除有另外规定,试剂均为分析纯,水为蒸馏水。甜蜜素(环己基氨基磺酸钠)标准品:纯度≥98%;正己烷:液相色谱纯;硫酸水溶液(1: 1) ;次氯酸钠水溶液(1: 1) ;酸氢钠溶液(5% ) 。

1.3　色谱条件

色谱柱: ODS - C18色谱柱, 250 ×4.6 mm ( I.D.) , 粒径4μm;流动相: 乙腈- 水( 70: 30 ) ; 检测波长: 314 nm; 流速:1.0 ml/min;进样量: 20μl;柱温:室温。

1.4　方法

1.4.1　样品处理

1.4.1.1　半固体及固体样品(淀粉含量少的) :称取试样约10 g(精确到0.01 g) ,放入250 ml烧杯中,加入60～70 ml蒸馏水,大火加热至沸后, 小火加热15 min。冷却后, 转移至100 ml量筒中,用蒸馏水定容至100 ml。取40 ml左右的样液放入离心管中, 3500 rpm 离心5 min 后,吸取上清液10 ml备用。

1.4.1.2　半固体及固体样品(淀粉含量多的) :称取试样约10 g(精确到0.01 g) ,放入250 ml烧杯中,加入60～70 ml蒸馏水,沸腾后小火加热1 min 后,振摇15 min。转移至100 ml量筒中,用蒸馏水定容至100 ml。取40 ml左右的样液放入离心管中, 3500 rpm离心5 min后,吸取上清液10 ml备用。

1.4.1.3　酱油类液体:吸取10 ml样品,用水定容至100 ml,吸取稀释液10 ml备用。

1.4.1.4　非酱油类液体(酒、糟卤、饮料等) :直接从样品中吸取10 ml样品备用。

1.4.2　标准溶液的制备

1.4.2.1　标准储备液:准确称取甜蜜素(环己烷氨基磺酸钠)标准品112.3 mg,放入100 ml的容量瓶中,加蒸馏水溶解后定容至100 ml,作为标准储备液, 4℃保存。该溶液1 ml相当于含甜蜜素1 mg。

1.4.2.2　标准工作溶液:分别准确吸取标准储备液0, 0.1,0.2, 0.5, 1.0 ml, 放入100 ml 容量瓶中用蒸馏水定容至100 ml,作为甜蜜素的标准工作液。该溶液1 ml分别相当于含甜蜜素0, 1, 2, 5, 10μg。

1.4.3　测定　分别吸取10 ml标准工作溶液、样液至125 ml分液漏斗中,加入2 ml 1: 1硫酸和5 ml正己烷,再加入1ml 1: 1次氯酸钠溶液,剧烈摇动1 min,静置分层,弃下层水层。再于正己烷层中加入5%碳酸氢钠溶液25 ml,摇动1 min,弃下层水层。上层正己烷供高效液相色谱测定。

2　结果与讨论

2.1　仪器参数的确定

2.1.1　波长的选择　N,N - 二氯环己胺在210 nm 和314 nm均有极强的吸收能力,但检出波长为210 nm 时,仪器基线不平稳,而且杂峰数量较多。而在波长314 nm 下,基线比较稳定,图谱上杂峰也极少,分离和检测效果满意。

2.1.2　流动相配比的选择　实验发现,流动相配比随着乙腈浓度的增加,甜蜜素出峰时间提前,但是峰形偏宽,而且灵敏度降低,本实验采用的流动相最佳配比是乙腈:水= 70: 30。

2.2　样品处理

2.2.1　加热时间对固体样品的影响　对于鸡块、包子、饺子等淀粉含量高的固体样品,如果加热15 min,样品糊化、乳化现象严重,萃取困难,回收率降低。而沸腾后小火加热1 min 就可以使甜蜜素大部分溶解在水中。因此对易糊化的淀粉类样品采取沸腾后小火加热1 min,然后在摇床振摇15 min 的前处理方法。而对蜜饯类不易乳化固体样品,加热时间长短对结果影响不大。

2.2.2　酱油的前期处理　实验发现,酱油按照液体处理方法,直接吸取10 ml到分液漏斗进行萃取反应,加标回收率几乎为零。如果吸取酱油10 ml用水稀释到100 ml,再取稀释液进行萃取,则获得较高的回收率。

2.3　线性关系

上表结果表明,最终溶液中甜蜜素浓度在1～100μg/ml范围,峰面积A与浓度C成线性关系,回归方程为A = 01814C+ 01683,相关系数为019999。

2.4　回收率与精密度试验

以鸡块、包子、酱油等基质复杂、干扰多的样品为例,进行回收率实验,结果见表1。

表1　甜蜜素在复杂食品基质中的添加回收率及精密度( n = 6)

样品   添加水平    回收率范围(% )   平均回收率(% )    RSD (% )

固体  鸡块    2 mg/kg     70.0～81.2           75.1           4.33

5 mg/kg     70.5～86.2           79.5           5.90

10 mg/kg     79.2～91.9           86.2           4.68

25 mg/kg     84.8～92.2           88.8           3.32

50 mg/kg     85.2～94.3           89.1           3.39

包子   25 mg/kg     80.5～87.1           84.5           2.58

50 mg/kg     78.5～90.4           84.6           4.73

液体  酒　   0.5 mg/L     88.3～106            95.0           6.28

1 mg/L       89.3～110            96.4           7.31

糟卤   10 mg/L      70.2～87.2           79.2           5.70

酱油   50 mg/L      79.3～100            88.4           7.74

215　图谱

图1　标准品色谱图

图2　鸡块加标回收( 2 mg /kg)图谱

3　小结

本文采用次氯酸钠在酸性条件下将甜蜜素转化为氯基环己烷,用正己烷萃取,用液相色谱柱分离,不仅大大减少一些样品中复杂基质的干扰,而且测定低限低。对于固体样品,检测低限可达2 mg/kg; 对于干扰少的液体样品,检测低限为0.5 mg/L,回收率在70% ～110%范围内。该方法快速简便,灵敏度高,干扰少,适用于大部分食品样品的测定。

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注：1、在《中国卫生检验杂志》2007年 8月第 17卷第8期　上发表

    2、作者单位  上海出入境检验检疫局食品中心